Rumah Sakit Umum Daerah (RSUD) Nyi Ageng Serang dibentuk berdasarkan Peraturan Daerah Kabupaten Kulon Progo No 12 Tahun 2015 tentang Pembentukan Organisasi dan Tata Kerja Rumah Sakit Umum Daerah Nyi Ageng Serang, dengan uraian tugas sesuai Peraturan Bupati Kulon Progo No 61 Tahun 2015 tentang Uraian Tugas Pada Rumah Sakit Umum Daerah Nyi Ageng Serang. Untuk izin operasionalnya berdasarkan Keputusan Kepala Badan Penanaman Modal dan Perizinan Terpadu Kabupaten Kulon Progo No 445/01/I/2019 tentang Izin Operasional Rumah Sakit Kelas C.

Sesuai dengan Peraturan Daerah Kabupaten Kulon Progo Nomor 12 Tahun 2015 tentang Pembentukan Organisasi dan Tata Kerja RSUD Nyi Ageng Serang, RSUD merupakan Perangkat Daerah penyelenggara pelayanan kesehatan perorangan secara paripurna. RSUD dipimpin oleh Direktur yang berada di bawah dan bertanggung jawab kepada Bupati melalui Sekretaris Daerah.